כנות והרכבות - תיאור מקיף של הפעלת המחקר

 
1) יצירת תשתיות מחקר
1א. איסוף חומר גנטי (ג'רמפלזם) המיועד לשמש ככנות (עגבניות- אוכלוסיות שונות של מוטנטים הקיימות בארץ, דלועיים- מהאוסף שבנווה יער, כאשר רוב כנות הדלעת הם מיכלואים בין Cucurbita maxima X C. moschata). בנווה יער קיים מגוון רחב של שני המינים ומיכלואים בין מיניים רבים. לא ידוע עד כה האם יש שונות בין הקבוצות או בתוך הקבוצות לתכונות של קליטה והולכה של מלחים או לרגישות לטמפרטורות קרקע גבוהות. בנוסף ייבדק חומר גנטי של החברות השותפות למחקר עליו קיים ידע גנטי חלקי (חישתיל, רוטיליטי, וסינג'נטה ישראל). החומר הגנטי ייבדק בשטחי המחקר של הפקולטה לחקלאות ואוניברסיטת בן-גוריון, וכן בשטחי המחקר של החברות השותפות.
1ב. מניפולציות גנטיות (בעגבניות). הפיתוחים האחרונים בתחום עריכת הגנום מאפשרים היום לבצע שינויים מכוונים ברצף DNA ספציפי. הטכנולוגיה המבטיחה ביותר היא ה- CRISPR/Cas9 . שיטה זו הוכחה כיעילה ליצירת מוטציות חסר בעגבנייה (Brooks et al., Plant Physiol 2014). שימוש בשיטה זו יאפשר בעתיד להתייחס לחומר הצמחי החדש כלא מהונדס גנטית. הגנים שייבחרו לפגיעה יהיו גנים המעורבים ביצור וחישה של הורמונים המעורבים בהתפתחות השורש כמו ציטוקינין, אוקסין, ג'יברלין, ו- ABA. בנוסף, נערוך מניפולציות גנטיות לביטוי ביתר של גנים אחרים ליצירת כנות טרנסגניות. מכיוון שמדובר רק בשורשים טרנסגנים ולא בנוף ו/או יבול טרנסגני, יתכן ובעתיד ניתן יהיה לשווק אותן ביתר קלות מבחינת רגולציה ל- GMO (ייעשה בעגבניות). ניצור צמחי עגבנייה טרנסגנים בהם גנים המעורבים בייצור, פירוק או חישה של ההורמונים ג'יברלין, ציטוקינין, אוקסין, ו- ABA מבוטאים ביתר או מושתקים. ג'יברלין- עבודות שונות, הראו שהורדת פעילות ג'יברלין בצמח מגבירה עמידות לעקות יובש ומלח (Nir et al., 2014; Achard et al., 2006). שינויים בפעילות הג'יברלין או ברמתו בשורש יכולים להשפיע באופן ישיר על התפתחות השורשים אך גם על הצמחים המורכבים דרך הורדת רמת ההורמון המיוצא מהשורש דרך ההרכבה לנוף. בכדי לעכב את סיגנל הג'יברלין בצמחי עגבנייה ניצור מוטציות חסר בגן המקודד לרצפטור לג'יברלין GID1A על ידי שימוש במערכת ה- CRISPR/Cas9 (צמחים אלה כבר ייוצרו והם נמצאים בשלב ההקשחה). במקרה זו אנו צופים לעיכוב התארכות שורשים אך יתכן שבדומה להשפעת ההורמון בנוף, עיכוב פעולתו יביא להתפצלות מוגברת של השורשים ושינוי נפח בית השורשים. במקביל ניצור צמחים המבטאים ביתר את הגן GA METHYL TRANSFERASE (GAMT) אשר מוריד את רמות הג'יברלין הפעיל ע"י מתילציה של הקבוצה הקרבוקסילית. Nir et al., (2014) הראו שביטוי ביתר של חלבון זה מגביר עמידות של צמחי עגבנייה ליובש. ציטוקינין- מעכב התפתחות שורשים ולכן הורדת רמתו מעודדת את התפתחות השורשים (Werner et al., 2001). לשם הגברת התפתחות השורשים ניצור מוטציה בגן ISOPENTENYL TRANSFERASE(IPT) תוך שימוש במערכת ה- CRISPR/Cas9. הגן IPT הוא שלב מפתח ביצירת ציטוקינין והגנים SlIPT3/4פועלים בשורשי העגבנייה (Žižková et al., 2015). במקביל נבטא ביתר את הגן CYTOKININ OXIDASE/DEHYDROGENASE (CKX). גן זה מקודד לאנזים המפרק ציטוקינין פעיל ומוריד את רמתו. עבודות קודמות הראו שביטוי ביתר של גן זה מעודד התפתחות שורשים (Werner et al., 2001). אנו נבטא את הגן בצמחי עגבנייה תחת בקרת הפרומוטר 35S ונשתמש בצמח המהונדס ככנה להרכבות (כבר יצרנו את הצמחים הטרנסגנים והם גדלים בחממה). אוקסין- אוקסין מעודד התפתחות שורשים, אך רמה גבוהה שלו יכולה לעכב את ההתפתחות. בכדי לבדוק האם ניתן להשפיע באופן חיובי על התפתחות השורשים תוך מניפולציה של סיגנל האוקסין, נבטא ביתר את הגן המקודד לחלבון השעתוק המעודד את סיגנל האוקסין, SlARF5 ((Zouine et al., 2014. במידה והטרנסגן יעודד את התפתחות בית השורשים, נשתמש בו ככנה להרכבות. ABA- להורמון ABA יש חשיבות גדולה בהתמודדות צמחים עם עקות יובש. ההורמון משפיע הן על משק המים של הצמח והן על התפתחות הנצר והשורש. אנו ננסה לבדוק האם הגברת הרגישות של השורשים להורמון יכולה לשפר את התמודדות הצמחים עם עקות א-ביוטיות. לשם הגברת הרגישות נבטא ביתר את הרצפטור ל- ABA PYR/PYL מעגבנייה (González-Guzmá et al., 2014). את הגן נבטא בצמחי עגבנייה תחת בקרת הפרומוטר 35S ונשתמש בצמח המהונדס ככנה להרכבות.

2)
אפיון שילובים של כנה-רוכב וצמחים לא מורכבים במצעים מנותקים ובקרקע בחשיפה לעקות יובש, מליחות וטמפרטורות קיצוניות ולשילוב שלהן

התגובה לעקות סביבתיות (טמפרטורה גבוהה ונמוכה ומלח) של קווי העגבנייה והדלועיים שייאספו והקווים שיפותחו במהלך הפרויקט, תבחן תחת תנאים מבוקרים ברחובות, שדה בוקר ובנווה יער. הניסויים יועמדו בפיטוטרונים המאפשרים שליטה מלאה על טמפרטורות. ברחובות צמחי עגבניות יגודלו בטווח של טמפ' החל מהחדר הקר ביותר (10/16oC יום/לילה) ועד לחדר החם ביותר (28/34oC, יום/לילה) בארבעה חדרים (עלייה של oC6 בין כל חדר). בשדה בוקר ייבחנו הצמחים במערכות איירופוניות ייעודיות בהן טמפרטורת השורשים תשתנה (בדומה לרחובות) וטמפרטורת הנוף תהיה אחידה. בנווה יער ייבחנו הדלועיים בתנאי השדה. במקביל תבחן סבילות הקווים לתנאי מליחות (לאחר ניסוי מקדים בתנאים מבוקרים עם ריכוזים עולים של נתרן כלורי, נבחר את הריכוז המתאים ביותר לכל סט של קווים). הצמחים יבחנו במדדים הבאים:
פנולוגיה וגידול - ביומסת שורש ונוף, שטח עלווה ושורשים, ארכיטקטורת שורשים (יחס הסדרים השונים במערכות השורשים). פוריות ויבול - זמני פריחה, מספר פרחים לצמח, חיוניות גרגרי אבקה, אחוזי חנטה, גודל פרי והערכת יבול. איכות הפרי לאחר הקטיף - עגבנייה תיקטף במצב הבשלה של אדום בהיר (צבע פרי 6-7 על פי טבלת אגרקסקו) ותאוחסן ב- oC12 למשך 12 ימים + 3 ימים ב- oC20. מלון ייקטף בשלב הבשלה של כ-2/3 צהוב וכ-1/3 ירוק, יישטף בהברשה חמה ויאוחסן ב- oC5 למשך שבועיים + 3 ימים ב-oC20. אבטיח ייקטף כאשר הקנוקנת החלה להתייבש וכתם הקרקע מינימלי. הפרי יאוחסן למשך 10 ימים ב- oC20. מדדי איכות בתום תקופת האחסנה וחיי מדף: א. איבוד משקל ממשקל התחלתי (באחוזים); ב. גמישות פרי בעזרת פנטרומטר (מלון) ודורומטר (עגבנייה); ג. כלל מוצקים מומסים (%סוכר) – על ידי סחיטת מיץ מציפת הפרי על גבי רפרקטומטר (כול הגידולים); ד. ריקבון (אחוז פרי רקוב מכלל הפירות, כל טיפול יכלול 4 קרטונים של פרי מאיכות ייצוא, כאשר מפרי האבטיח ייקטפו 12 פירות מכל טיפול). פיטוהורמונים- ABA, ג'יברלין וציטקינינים ייבדקו בחלקי הצמח השונים בשלבי התפתחות שונים בתנאי הגידול השונים. מדדים פיזיולוגים - יעילות פוטוסינתזה, תכולת כלורופיל, מוליכות פיוניות, פלורסנציה של כלורופיל, תכולת מים בעלה, יציבות ממברנות (CMS), פוטנציאל עלה וגבעול, אנטומית שורשים, הידראוליקה של נוף ומערכות שורשים. הקווים שיבחנו תחת תנאי מליחות, יבחנו גם לתכולת יונים של כלוריד, נתרן ואשלגן בעלים, שורשים ופירות. בחינה של מאזני מים של הצמח השלם תערך בצורה השוואתית בין הקווים השונים של ההרכבות הרציפרוקליות ובתנאי רטיבות קרקע ותנאי הזנה שונים. המדידות יעשו בשיתוף קבוצות המחקר של פרויקטים א' ו ב'. יחסי שורש נוף - מוהל השיפה של צמחים עילאיים מכיל, מלבד סוכרים, חומצות אמינו ומולקולות קטנות, מגוון רחב של חלבונים ומולקולות mRNA. חלק מאותם חלבונים מעורב בתקשורת בין רקמות הצמח ובמיוחד בין השורש לנוף. אחד החלבונים הנפוצים במוהל השיפה, Cyclophilin1 (Cyp1), חשוב במערכת התקשורת בין העלווה לשורשים. בעבודה הקדמית התבצע אפיון של צמחי עגבנייה בעלי מוטציית diageotropica (dgt) שנמצאו כפגועים בגן SlCyp1. צמחים אלו לא מגיבים לאוקסין ומאופיינים בפנוטיפ פליאוטרופי שכולל פגיעה בגרוויטרופיזם, התעבות משנית מוגבלת והעדר שורשים צדדיים. במערכת הרכבות רציפרוקליות נמצא כי הרכבת צמח ביקורת כרוכב על המוטנט dgt (כנה) גרמה להתפתחות מואצת של שורשים צדדיים במוטנט, כמעט כמו בצמח הביקורת. בהמשך נמצא כי החזרת היכולת לפתח שורשים צדדיים נובעת מתנועה של החלבון Cyp1 מהנוף של צמח הביקורת אל שורשי הכנה המוטנטית. באנליזה טרנסקריפטומית מפורטת (RNAseq) זוהתה סדרת גנים שמופעלים או מושתקים בשורשים כתוצאה מהתנועה של Cyp1 מהנוף לשורש. יתרה מכך, צבירה של Cyp1 בעלים וקצב ההובלה שלו לשורשים היה מושפע מצפיפות שטף הקרינה. קרינה גבוהה יותר גרמה להגדלת הריכוז של החלבון בעלווה. כמו כן גרמה עליה בצפיפות שטף הקרינה להגברת ההובלה של חלבון זה לשורשים בהשוואה לשינוי בהובלה של חלבונים אחרים. תוצאות אלו מעידות על מעורבותו של החלבון בתקשורת בין הנוף לשורש לצורך יצירת איזון בין התפתחות הנוף והתפתחות השורשים בתגובה לתנאי סביבה משתנים. כמו כן יצרה עבודה זו תשתית מחקרית ללימוד הגורמים המבקרים התפתחות שורשים צדדיים. בפרויקט זה נבחן את ההשפעה של שילובי גנוטיפים בין כנה ורוכב על ביטוי החלבון Cyp1בנוף ועל הובלתו לשורשים. נברר את הקשר בין התפתחות תקינה של שורשים, במערכת זו של הרכבות, ובין הביטוי והמיקום התאי/תוך תאי של החלבון המובל מהנוף. צמחי עגבנייה ומלפפון מהונדסים המבטאים את החלבון המאוחה ל-GFP ישמשו כרוכבים ויאפשרו מעקב אחר תנועת החלבון לכנה וזיהוי מדויק של אתר המטרה בשורשים. לאחר שזיהינו סדרה של גנים שמופעלים או מושתקים בשורשים כתוצאה מהתנועה של Cyp1 לשורש, נבחן את הקשר בין רמת הביטוי שלהם ובין הנצה של שורשים צדדיים. בנוסף תעשה בחינת החיבור וצורת התאים ברוכב ובכנה בנפרד ובאזור החיבור בו יש לרוב תאי קאלוס. הסתכלות על מבנה התאים מאפשרת להבין את סוג החיבור והתקשורת בין הרוכב והכנה מערכת ניסויים זו תאפשר לברר את המנגנון המולקולארי המעורב בבקרה על התפתחות השורשים.
מדדים גנטיים - קווים מצטיינים שיראו סבילות הן לתנאי טמפרטורה גבוהה והן לתנאי מליחות יבחנו גם לשילוב של שתי העקות ביחד על מנת לחפש קווים שיכולים להתמודד עם שלוב עקות. קווי ההתמרה שיבחנו יחד עם החומר הגנטי, ישמשו למיפוי של אתרי תכונות כמותיות (QTL) התורמים לשיפור העמידות לאחת העקות או לשילוב של עקות, והם יחוברו עם המידע הגנטי הקיים למיפוי עדין של התכונות ולשם פיתוח סמנים שישמשו לטיפוח תלוי סמנים (MAS). קווים מבטיחים שיבחרו לשמש ככנות, יורכבו עם קווי רוכב מצטיינים הקיימים בחברות ויבחנו תחת תנאי שדה לבחינת ההשפעה על מרכיבי היבול ואיכותו.

3)
הבנת המנגנונים לעמידות כנות לעקות אביוטיות משולבות
לאחר השלב הראשוני ייבחרו כנות עמידות ורגישות במיוחד לעקות אביוטיות והן ייבחנו בשלובי עקות של טמפרטורה, יובש ומליחות. כל המדדים שהוזכרו לעיל ייבחנו גם בניסויים אלה. בנוסף נמצא ונפתח סמנים גנטיים ומטבוליים לצורך שימוש בתוכניות טיפוח מולקולריות במספר מצומצם של זנים שיראו עמידות גבוהה לשילוב של עקות - במטרה לזהות גנים ומטבוליטים התורמים לשיפור העמידות של צמחים העגבנייה לתנאי עקות סביבתיות (מלח וטמפרטורות קיצוניות) הן בכנה והן בצמחים המורכבים יבוצע פרופיל טרנסקריפטומי ומטבולומי של הצמחים. קווים מסחריים הנפוצים בישראל (לא מורכבים) ישמשו כקו ביקורת לניסוי ומולו יבחנו שילובים מבטיחים של כנות ורוכבים כפי שזוהו בסריקה הפיזיולוגית. דוגמאות של עלים ושורשים ידגמו מצמחים שגודלו תחת משטר מיטבי ותחת תנאי עקה (אחת או משולבת). דוגמאות יילקחו לפני תחילת העקה, ובמספר נקודות זמן לאורך התפתחות העקה, תוך שימת דגש לשלבים הרפרודוקטיביים המשפיעים על היבול ואיכותו. פרופיל מטבולי ייעשה בעזרת GC/MS ובעזרת (Hochberg et al., 2015) LC/MS. פרופיל טרנסקריפטום יתבצע ע"י RNAseq במכשיר ריצוף (Illumina HiSeq 2500). הנתונים שיתקבלו ינותחו על מנת לזהות דגמי ביטוי שונים הן בקווים, באיברים ובטיפולים השונים במטרה לזהות מסלולים מטבוליים התורמים לעמידות (או רגישות) לעקה בדידה או שילובי עקות (כמוסבר למעלה). הנתונים הגנומיים יאוחדו בהמשך בניתוח ביואינפורמטי עם נתוני מטבולום (ראה למעלה). ניתוח רגרסיה רבת משתנים (PCA) יבוצע במטרה לזהות מסלולים מטבולים הנבדלים בין הכנה לרוכב ובין טיפולי עקה שונים במטרה לזהות את המסלולים העיקריים בהם נרצה להעמיק. בנוסף, גנים מבקרים (regulatory genes) שנבדלים ברמת הביטוי בין הכנה לרוכב יבחנו לאפיון רמת התנועה של החלבונים והאותות בין הכנה לרוכב. בנוסף, אנחנו נשתמש באוכלוסיית קווי התמרה על מנת למפות גנטית את המטבוליטים (mQTLs) והגנים שהראו דגם ביטוי שונה (eQTLs) במטרה לפתח סמנים גנטיים (SNPs) שיוכלו בהמשך לשמש לצורך טיפוח תלוי סמנים של זני עלית חדשים.

4) פיתוח ויישום השימוש במידע על המאפיינים, המנגנונים והבסיס הגנטי לשימוש ככלי מדידה בשורשים בכלל על פי צרכי השווקים העולמיים והישראלים
על מנת לבחון את תוצרי הפרויקט ולצור פרוטוקולי גידול ייערכו ניסויים חצי מסחריים. הרכבות מיטביות ייבחנו בשלוש מקומות שונים מבחינת תנאי האקלים ואיכויות מי ההשקיה: נווה יער, מו"פ רמת-נגב ומו"פ ערבה תיכונה. הניסויים יבחנו רמות שונות של מליחות מי השקיה וכמות מי השקיה. בנוסף תיבחן יכולת הניבוי והסמנים על מערכות שורשים בצמחים לא מורכבים בעגבניות ובדלועיים.