משפרי גידול בסביבת בית השורשים - תיאור מקיף של הפעלת המחקר

 
              1. עידוד גידול והתבססות שתילים מאולחים בחיידקי Azospirillum brasilense. A. brasilense בעלי יכולת אכלוס שטח פני שורשים ומעודדים התפתחות של מערכת שורשים בגידולים רבים (Dobbelaere et al., 2001). ההשפעות החיוביות של אזוספירילום נובעות בעיקר משיפור התפתחות מערכת השורשים וקליטת מים ומינרלים. החיידק משפיע על המאזן ההורמונלי בשורשים כאשר הוא בעצמו מסנתז ומפריש חומרי צמיחה כגון אוקסין (Spaepen et al., 2009). עגבנייה ומלפפון נמנים בין הגידולים הרבים שהראו תגובה חיובית לאילוח בחיידקי אזוספירילום מבחינת התפתחות ופעילות השורשים (Hadas and Okon, 1987; Mangmang et al., 2015), אם כי, מעט עבודות נעשו עם צמחים אלו בהשוואה למשל לצמחים ממשפחת הדגניים והקטניות. במסגרת הפרויקט נבחן את היישום של אזוספירילום על התפתחות ופעילות מערכת שורשים בצמחי עגבנייה ודלועיים. בתחילת הפרויקט נערוך מספר ניסויים בפקולטה לחקלאות. בהתחלה נתמקד בשתילים של עגבניות ומלפפון (שני זנים כ"א, על פי התייעצות עם אנשי חישתיל) בשילוב עם שלושה זנים של A. brasilense שמהווים את זני המודל של החיידק: Cd, Sp7ו- Sp245. חיידקים אלו זמינים במעבדתנו. הניסויים ייערכו בתנאים (טמפרטורה, לחות, מצע גידול) שמדמים תנאי משתלה. בניסויים שונים נבחן את הגורמים הבאים עבור כל שילוב של זן צמח-חיידק: צורת הוספת החיידק (אילוח זרעים לעומת תוספת ישירה למצע הגידול באמצעות תרחיף, נשא כבול, או דרך מערכת ההשקיה); מועד מתן החיידק (בזמן הזריעה או במספר מועדים לאחר הזריעה ושילוב ביניהם); ריכוז החיידקים (מהווה גורם מאד חשוב היות וההשפעה של החיידק היא בעיקר ע"י השפעה על מאזן ההורמונלי של השורשים ולכן יש למצוא את הרמה האופטימאלית לכל שילוב). הטיפולים יושוו לביקורות מתאימות ללא טיפול בחיידק. נעקוב אחר התפתחות השתילים לאחר כ- 4 שבועות, מועד בו השתילים מוכנים להעברה לשדה/בית צמיחה. ייבדקו התכונות הבאות: בדיקה מורפולוגית של השורשים כולל השפעה על צפיפות מערכת השורשים כפי שנראה באופן חזותי והיווצרות של יונקות (במיקרוסקופ), ביומסה של שורשים ושל הנוף, תכולת חלבון בשורשים, בדיקת קצב נשימה, ריכוז אוקסין (IAA). כמו כן, ייערכו ניסויים על מנת לבחון את מידת ההישרדות של הזנים השונים של החיידק באינוקולטנים (נוזלים ועל בסיס כבול) ובמצע הגידול לאורך זמן לאחר מתן הטיפול. לאחרונה בודדנו תבדידים בעלי שינוי מופע (phenotypic variants, PVs) של A. brasilense Sp7, המאופיינים בייצור מוגבר של פוליסכריד חוץ-תאי (extracellular polysaccharides). אפיון של חלק מהתבדידים הראה שהם בעלי כושר הישרדות גבוה יותר בהשוואה לזן Sp7 תחת תנאי עקה שונים כגון יובש, לחץ אוסמוטי, מליחות ותנאים חומציים (Lerner et al., 2010; Volfson et al., 2013). כמו כן, בניסויים מבוקרים, תבדידים אלו לא נבדלו מ- Sp7 בכושר עידוד צמיחה על צמחי תירס, חיטה, סויה ואגוזי אדמה. אנו נבצע ניסויים בהם נשווה בין תבדידים בעלי שינוי מופע נבחרים לבין הזן Sp7 בניסוי הישרדות בקרקע ובניסוי עידוד צמיחה בעגבנייה ובמלפפון (בתנאים המיטביים שיוגדרו בניסויים הקודמים). בהמשך, טיפולים נבחרים מבחינת שילוב של זן חיידק, ריכוזו וצורת היישום ייבחנו בניסויים בהיקפים חצי-מסחריים בשיתוף עם משתלת חישתיל. בניסויים אלה, ייעשה מעקב ברמת המשתלה על פי המדדים שתוארו לעיל (לגבי מורפולוגית השורשים, תיבדק התפרצות השורשים מהגוש המטופל מס' ימים לאחר העתקה שכן ברמת השתיל, יש מגבלה לזהות הבדלים בין גושי השורשים מיד עם שליפתם מהגוש). אנו נעקוב גם אחר התפתחות הצמחים לאחר העברתם לשדה/משתלה (בעיקר בפרמטרים של הנוף כגון משקל יבש והרכב מיקרו ומאקרואלמנטים). במהלך השנה השנייה והשלישית של הפרויקט, נשלב זנים נוספים של עגבנייה, דלועיים נוספים, וגידולים נוספים (בהתייעצות עם אנשי חישתיל), ראשית בניסויי חממה בפקולטה ובהמשך בניסויים במשתלה כפי שתואר מעלה.

 
 
 
 
 
 
 
2. הגנה מפני פתוגנים בשתיל ובצמח המתבסס
א. יעילות החיידק Paenibacillus dendritiformis כנגד ריקבון של תפו"א הוכחה הן בחממה והן בשדה. בשלב ראשון, ייערכו ניסויים במעבדה ובתנאים מבוקרים בחממות בפקולטה לחקלאות. בהמשך, נבצע ניסויים בקנה מידה גדול בשדה בקיבוץ יטבתה. היעילות של P. dendritiformisבהדברת החיידקים הגורמים לריקבון הרך תבחן על פקעות זריעה אשר נפסלו לשתילה עקב מופע של תסמיני מחלה התחלתיים. בנוסף, נערוך ניסויי הדברה על פקעות שאולחו באופן מבוקר עם תבדיד של Pectobacterium carotovorum שבודד על ידנו מפקעות נגועות שיובאו מהולנד. אנו נערוך השוואות של מדדי יבול (משקל ומספר הפקעות ואינדקס מחלה) בין שתילים שאולחו ב- P. dendritiformis לבין שתילי ביקורת. ההשוואות יערכו על שתילים בני כ- 60 יום בחממה ו- 120 יום בשדה. בנוסף, היות ובמקרים רבים תסמיני המחלה מופיעים בשלבי האחסון המאוחרים יותר, ימשך המעקב לאחר אחסון תפו"א למשך 30 יום נוספים. יעילות P. dendritiformisכמדביר וכמדשן תבחן ע"י הוספתו בתכיפות ושלבי גידול משתנים. כמו כן, ייבדקו צורות שונות של אילוח כגון השקיה עילית (המטרה וקו-נוע); החדרה באמצעות טפטפות; החדרה באמצעות הזרקה לאדמה בזמנים שונים לאורך הגידול; החדרה בו זמנית עם שתילה; וכיסוי פקעות תפו"א בחיידקים לפני השתילה בריסוס בנפח נמוך. היות ו- P. dendritiformisהוא חיידק גרם חיובי היכול לייצר נבגי בר קיימא, תיבדק גם האפשרות של הוספת P. dendritiformisכאבקה שתיוצר מנבגי החיידק.
ב. יישום חיידקים טורפים כנגד הפתוגנים Pectobacterium ו-Dickeya יעשה באופן מדורג. ראשית, תבדידים שונים של חיידקי BALOs ייבחנו כנגד מגוון רחב של תבדידי Pectobacterium ו-Dickeya. אחד היתרונות הבולטים של BALO הוא טווח הפעילות הרחב שלהם (Jurkevitch et al., 2001). הטורפים ייושמו על פקעות תפו"א בתנאי מעבדה על מנת לקבוע טווחי פעילות של ריכוזים שונים של פתוגן ושל חיידק טורף. ריכוז הטורף והטרף יכומת לאורך זמן תוך כדי המעכב אחרי עיכוב בהתפתחות ומידת המחלה. יישום הדברה ע"י חיידקים טורפים יעשה בתנאי חממה לבדיקת אופן הבאה החיידקים לפקעת ע"י השוואה של בין מתן בהשקיה, ציפוי וטיפולים משולבים. הניסויים ייכללו טיפולי ביקורת ללא BALO. בשלב שני, תיבחן יכולת ההדברה בשדה בהתאם לטיפול המובחר, ובמערך ניסוי מקביל לזה המוצע מעלה.
ג. יישום מדבירים מבטיחים חדשים. בידינו מספר גדול של חיידקים בעלי פעילות גבוהה של דיכוי פתוגנים במעבדה (ראה טבלה 1). לחיידקים אלו פעילות נגד טווח פתוגנים גדול (פטריות, אואומיצטים וחיידקים). חיידקים אלו בודדו מקרקעות שונות בארץ והם עמידים לתנאי קיצון. לאחר סקלציה של התבדידים הפעילים ביותר (נמצא כבר בתהליך כרגע) שייבחרו למחקר יבוצעו ניסויי חממה לבחינת עיכוב הפתוגנים במערכות צמחי מודל מתאימים בתנאים שונים ושיטות ומשטרי יישום שונים (ריכוזי יישום, מועדי יישום, יישום בתנאי רטיבות/חום שונים, יישום לפני/יחד/אחרי הפתוגן וכו'). במקביל, ייבחנו צמחי ביקורת אשר יטופלו במדבירים הפוטנציאליים ללא הפתוגנים, לבחינת השפעה שלילית על הגידולים הנבחנים.
זהות החיידקים שייבחרו בניסויי החממה ככאלו שלהם יכולת הדברתית גבוהה, תיקבע גנטית ע"י ריצוף הגן המקודד ל 16S rRNA כמקובל. לתבדידים מבטיחים אלו נבחן יישום של יותר מתבדיד אחד בו זמנית (קונסורציום), יישום נבגים מול חיידקים וגטטיביים, יישום בפורמולציות שונות, אורך חיי המדף ושרידות התבדידים בקרקע לאורך זמן. בנוסף, פעילותם של התבדידים הללו תיבדק כנגד המחלות שתוארו בפרקים הקודמים (מחלות ממקור חיידקי כגון Pectobacterium ו- Dickeya) כמתואר לעיל בחממה ומשדה, ויכולתם לעודד גידול שורשים תיבחן גם היא. באופן זה, תיבנה עתודה של מיקרואורגניזמים בעלי פוטנציאל יישומי למטרות מחקר זה.
ד. שילוב מיקרואורגניזמים. ננצל את העובדה כי BALO הם ספציפיים לחיידקים גרם שליליים ו- P. dentriformis ומרבית המדבירים האחרים (טבלה 1) הם גרם חיוביים ולכן אינם מותקפים ע"י BALO כדי ליישם הדברה משולבת הכוללת מספר חיידקים בתערובת ולבדוק אם ניתן להגביר את יעילותם של המדבירים בדרך זו. שילוב בין BALO לחיידקים נוספים ייבחן כנגד מחלות בקטריאליות שונות. בנוסף, חיידקי BALO הינם ספציפיים למחצה ובידינו תבדידים אשר אינם פוגעים ב- A. brasilense, דבר המאפשר לשלבם גם עם מעודד הגידול.
3. אוכולוסיות החיידקים שבריזוספרה ובקרקע (הרחק מהצמח) יאופיינו בעזרת ריצוף גנים בעזרת 16S rRNA. הצמחים ותנאיי הקרקע ייבחרו בהתאם להתקדמות בשלבים א' וב' של הפרויקט. כמו כן, נבצע ריצוף מטגנומי (דהיינו של סך הגנים של החיידקים בדוגמא) על מנת לפענח את פוטנציאל הפעילות שלהם. הדוגמאות גם יכללו צמחים מאולחים ע"י החיידקים המועילים הנ"ל Azospirillum, Paenibacillus, BALO)) דבר שיאפשר למדוד ולעמוד את פעילותם והשפעתם על חיידקי הריזוספרה.
4. מאפייני התנועה והספיחה של משפרי גידול ביולוגיים וכימיים בקרקע
ניטור חתך הקרקע עבור משפר גידול נתון בתחילת ובמהלך עונת ההשקיה. יקת החומרים המסיסים ו\או החלקיקים באמצעות תמיסה המדמה את ההרכב הכימי של מי השקיה נתונים. מידת התנועה והחיות של המדבירים הביולוגים לעומק בדוגמאות אלו יבחנו על ידי אנליזה מולקולארית כמותית של גן 16S rRNA qRT'PCR בעומקים שונים. ספיחה ויצור ביופילם תבחן בעזרת פרובים גנטיים (FISH) למדבירים משולבים במיקרוסקופיה קונפוקלית של דוגמאות הקרקע. מידת הפרוק המיקרוביאלי של משפרי גידול כימיים תיבדק על בסיס ניסיונות מנתים וניסוי דחיקה מבוקרים עם משפרי גידול מסומנים בפחמן 31. מידת האבולוציה של פחמן דו חמצני מסומן (שתימדד בעזרת IRMS) תאפשר להפריד בין תהליכי פרוק ותהליכי ספיחה.
ב. חישוב מאפייני הספיחה יתבצע באמצעות סדרת ניסויי תנועה בעמודות קרקע, בתנאי זרימה (רוויה ואי-רוויה) יציבה, זרימה לסירוגין ומחזורי הרטבה\ייבוש. ניסויים אלו יאפשרו לקבוע מהם התנאים בהם משפר גידול נתון מגיע לשיווי-משקל כימי ו\או פיזיקלי בקרקע נתונה וכן יאפשר לכמת את יחסי הגומלין בין החומר הספוח לזה המסיס. בתום כל ניסוי, תבחן גם התפלגות הריכוזים (מסיס וספוח) בחתך הקרקע. סדרת ניסויי אלה תאפשר לאמוד את פירוס הריכוזים בחתך הקרקע בזמן נתון או לחילופין את שיעור השטיפה אל מעבר לבית השורשים.
ג. תוצאות החלק הניסויי של המחקר (סעיפים א ו-ב) ישמשו לכיול מודל מתמטי לתיאור תנועת המים ומומסים או חלקיקים בחתך הקרקע בהתאם לתנאי הזרימה כפי שיושמו בשדה או בניסויי המעבדה. לשם כך, יעשה שימוש בתוכנת HYDRUS-1D (Šimůnek et al., 2008) המאגדת מגוון רחב של מודלים לתיאור תנועת המים המומסים והחלקיקים בתנאי רוויה משתנים עבור תנאי אי-שיווי משקל כימי ו/או פיזיקלי. תהליכים נוספים הניתנים לתיאור במודל הם: פירוק מיקרוביאלי ו/או כימי (Wagenet and Hutson, 1987), קליטת מים ומומסים (אקטיבית או פסיבית) ע"י הצמח תוך התחשבות בעקת יובש (Genuchten, 1987; Simunek and Hopmans 2009). כיול המודל לתוצאות המדודות יתבצע ע"י פתרון הבעיה ההפוכה, דהיינו, אופטימיזציה של קבועי המודל, לשם קבלת ההתאמה המיטבית לתוצאות המדודות. המודל המכויל יאפשר לבחון תרחישים שונים שלא יבדקו בחלק הניסויי של המחקר.
טבלה 1. בחינת כושר עיכוב של תבדידי קרקע כנגד פיטו-פתוגנים שוכני קרקע מובחרים. היעדר עיכוב (-); רמת עיכוב נמוכה, בינונית, גבוהה (+, ++, +++). החיידקים בודדו מקרקע משדה חיטה בבית דגן (WF); קרקע מגילת (GS); קרקע מושקה בעקר (OMW); קרקע ממטע בננות בצמח (BP); קרקע חולית מושקית קולחים (LSTW) ; קרקע מפארק סיירת שקד (PSSNO); קרקע מנווה יער (NYG ו- CNY) וקרקע מושקית קולחים ומדושנת (TWF).
S. rolfsii Macrophomina Fusarium Isolate
++ ++ ND WF-2
++ +++ ND GS-3
++ ++ +++ GS-38
+ ++ ++ LSTW-32
++ +++ + LSTW-33
++ - ++ TWF-71
++ +++ ++ PSSNO-67
+ ++ +++ PSSNO-69
++ + +++ NYG-111
++ ++ ++ NYG-112
++ ++ ++ NYG-115
++ ++ ++ NYG-122
++ - +++ CNY94
++ ++ +++ CNY96
+ + ++ OMW123
++ ++ +++ OMW212
++ - +++ BP-2
- ++ +++ TWF-60